• Iker Irisarri , Pooja Singh , Stephan Koblmüller , Julián Torres-Dowdall , Frédéric Henning , Paolo Franchini ,
  Christoph Fischer ,  Alan R. Lemmon , Emily Moriarty Lemmon , Gerhard G. Thallinger , Christian Sturmbauer & Axel Meyer 

L'intégration de la datation moléculaire aux événements géologiques peut identifier les facteurs écologiques pertinents facilitant les radiations et fournir un contrôle indépendant pour les hypothèses d'hybridation. On suppose que le groupe d'espèces du lac Tanganyika est apparu au même moment que la formation et la maturation du lac il y a 12 à 9 Ma 26 . Cependant, les analyses de datation moléculaire ont suggéré des âges nettement différents d'environ 51 à 16 Ma 9 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 . Une controverse persiste également concernant les estimations d'âge pour les divergences les plus profondes dans l'arbre généalogique des cichlidés. On a initialement supposé que celles-ci suivaient la vicariance gondwanienne 32 , 33 , 34 , 35 . Les datations moléculaires récentes ont récupéré des âges significativement plus jeunes pour ces divisions qui contredisent le scénario de vicariance et ont donc émis l'hypothèse d'une dispersion transocéanique à longue distance des cichlidés 25 , 29 , 30 . Français En revanche, les datations moléculaires antérieures utilisant des étalonnages vicariants ont estimé des divergences beaucoup plus anciennes chez les cichlidés africains qui sont difficiles à concilier avec l'âge et l'histoire géologique des Grands Lacs africains et la biologie de leurs espèces endémiques 9 , 12 . La difficulté d'estimer des divergences cohérentes simultanément dans les régions plus profondes et moins profondes de l'arbre provient en partie de la rareté des fossiles fiables pour l'étalonnage (le plus ancien connu n'a que 45 millions d'années 36 ) et de l'absence d'une estimation fiable de la fréquence de l'horloge moléculaire pour les cichlidés.

 Ici, nous tentons de reconstruire un arbre généalogique robuste de cichlidés en nous concentrant sur le troupeau du lac Tanganyika, qui est calibré dans le temps en utilisant un fossile de cichlidé d'Afrique de l'Est récemment décrit 37 . Les réseaux phylogénétiques et les statistiques D de Patterson sont utilisés pour examiner les signaux d'hybridation entre les tribus de cichlidés. Nous trouvons des preuves d'hybridations à la base du troupeau du lac Tanganyika et de la tribu Haplochromini qui a ensemencé les radiations dans les lacs Malawi et Victoria. Ces résultats soutiennent le rôle de l'hybridation dans l'amplification de toutes les radiations majeures des cichlidés en Afrique de l'Est. En utilisant le nouveau cadre phylogénétique, nous analysons l'évolution moléculaire des gènes associés aux innovations clés des cichlidés. Nous trouvons une sélection positive associée à la colonisation du lac Tanganyika et identifions le régime alimentaire comme l'un des facteurs écologiques les plus importants.

L'arbre des espèces coalescent a retrouvé Steatocranini ( Steatocranus casuarius ) au sein du groupe du lac Tanganyika, comme groupe frère de toutes les autres tribus à l'exclusion de Bathybathini + Boulengerochromini (Fig. 1 ), tandis que l'arbre de vraisemblance maximale (Fig. 1 supplémentaire ) a retrouvé Steatocranini comme groupe frère du groupe d'espèces du lac Tanganyika qui comprend Bathybathini et Boulengerochromini. Nous interprétons cette différence comme résultant de l'hybridation (voir ci-dessous). Le deuxième désaccord topologique intertribal majeur concernait les relations au sein de la lignée H 42 (voir également Fig. 1 ) : les analyses coalescentes ont retrouvé la ramification successive de (i) Cyprichromini comme groupe frère de Benthochromini + Perissodini et (ii) Limnochromini + Ectodini, tandis que les analyses concaténées ont retrouvé ces deux clades comme groupe frère. 
Les études précédentes concordent généralement avec notre position retrouvée pour les Haplochromini (y compris les Tropheini) et la ramification plus profonde des Boulengerochromini, Bathybatini et Lamprologini, mais les interrelations précises entre toutes les autres tribus diffèrent significativement 11 , 15 , 17 , 18 , 25 , 41 . Les Eretmodini, dont le placement a été controversé dans les études précédentes 14 , 43 , 44 , 45 se trouvent dans la lignée H 11 , 17 , 25 , 30 , 42 , spécifiquement comme groupe frère d'Orthochromini + Haplochromini (y compris les Tropheini). Au sein des Haplochromini, les genres fluviaux Astatoreochromis et Astatotilapia se ramifient avant les deux clades majeurs représentant les radiations adaptatives dans le lac Victoria (> 500 spp.) et le lac Malawi (> 800 spp.). Notre phylogénie soutient l'évolution des Tropheini endémiques du Tanganyika à partir d'ancêtres fluviaux qui ont recolonisé le lac Tanganyika et se sont diversifiés parallèlement au rayonnement déjà existant 11 , 12 , 15 .

En prenant en compte les intervalles de confiance de 95 %, les deux aires de répartition concordent avec une diversification du troupeau d'espèces du lac Tanganyika associée à la colonisation du nouveau bassin lacustre (originaire de 12 à 9 Ma 46 ), qui a fourni de nouvelles niches et opportunités écologiques nécessaires à la radiation adaptative 10 . De même, il n'est pas possible d'exclure un scénario alternatif d'une origine plus ancienne de certaines lignées majeures. Cependant, le fait que toutes les tribus endémiques du Tanganyika, à l'exception des Lamprologini à ramification précoce, occupent des niches fondamentales brutes distinctes (guildes écologiques) 12 suggère que la radiation initiale s'est probablement produite dans les limites du système lacustre émergent. Au lieu de cela, si une grande partie de la divergence initiale s'était produite dans différents systèmes fluviaux avant la formation du lac (c'est-à-dire en allopatrie), on pourrait s'attendre à ce que chaque lignée rayonne en un éventail d'espèces occupant des niches plus larges, ce qui contredit le modèle observé aujourd'hui. Français Il est important de noter que les membres des tribus de cichlidés du groupe du lac Tanganyika ne sont présents dans aucun système fluvial voisin, à seulement trois exceptions près : (i) les Orthochromini, que l'on trouve exclusivement dans le bassin versant de Malagarazi et les rivières voisines qui se jettent dans le lac Tanganyika ; (ii) les Haplochromini originaires du Tanganyika, qui ont colonisé de grandes parties de l'Afrique, puis ont recolonisé le Tanganyika (Tropheini) ; et (iii) les Lamprologini qui contiennent deux lignées qui se sont dispersées du lac Tanganyika dans les systèmes fluviaux du Congo et de Malagarazi 47 . Là encore, une origine du groupe d'espèces du lac Tanganyika bien antérieure à la formation du lac devrait expliquer l'extinction de nombreux membres fluviaux des tribus tanganyikaises. En fait, d'autres lignées de cichlidés étroitement apparentées, dont certaines ont également colonisé le lac Tanganyika 41 , continuent d'être présentes dans les plans d'eau voisins.

L'étude récente proposant une dispersion transocéanique à longue distance des cichlidés a inféré des divergences apparemment trop anciennes (~50 Ma) pour le groupe d'espèces du Tanganyika 31 . Outre des différences substantielles dans la méthodologie de datation, les désaccords dans les temps de divergence entre cette étude et nos analyses pourraient être en partie dus à l'ensemble de données moléculaires sous-jacent, qui était sensiblement plus petit (40 loci) et dominé par des marqueurs mitochondriaux (~66 %) et des données manquantes (~40 %). L'élargissement de notre ensemble de données de loci ancrés pour inclure d'autres taxons non cichlidés, ce qui est simple pour les loci ancrés, permettrait d'incorporer des fossiles informatifs supplémentaires dans le groupe externe comme dans Matschiner et al. 31 et aiderait à clarifier les désaccords actuels sur la diversification des cichlidés. Une compréhension plus approfondie de la contradiction apparente entre les arbres temporels existants des cichlidés serait possible en menant une étude approfondie comparant différents logiciels/méthodologies de datation et ensembles de données moléculaires avec des hypothèses et des modèles comparables.

Les tests D de Patterson ont été effectués sur toutes les permutations possibles de quatre individus appartenant à chacun des trois groupes tests et le flux génétique a été interprété à partir des distributions des statistiques D (Fig. 3 ). Nous avons trouvé un signal fort de flux génétique entre Steatocranini et l'ancêtre des tribus « modernes » du lac Tanganyika (toutes les tribus sauf Bathybatini et Boulengerochromini ) représenté par des valeurs D négatives ( Z -score > 3 ; p ajusté par Benjamini-Hochberg  < 0,05). Ce signal d'hybridation était cohérent que Bathybatini ou Boulengerochromini soient utilisés comme P2 et quels que soient les taxons externes utilisés, alors qu'il disparaissait clairement lorsque Steatocranini (P3) était remplacé par d'autres lignées non tanganyikaises proches (c'est-à-dire Heterotilapiini ou Hemichromini ) (Fig. 3b et Tableau supplémentaire 3 ). Nous avons également trouvé un soutien solide à la deuxième hypothèse d'hybridation entre Benthochromini et Perissodini, montrée par des valeurs D systématiquement négatives ( Z -score > 3 ; p ajusté  < 0,05 ; Tableau supplémentaire 3 ).

Meyer et al. 25 ont proposé des événements d'introgression supplémentaires impliquant Boulengerochromini (ou l'ancêtre commun de Boulengerochromini + Bathybatini) et soit (i) la lignée H, soit (ii) l'ancêtre de Perissodini + Cyprichromini. Nos résultats montrent des schémas de flux génétiques contradictoires lorsque Boulengerochromini ou Bathybatini sont testés (tableau complémentaire 3 ), suggérant ainsi un scénario d'introgression beaucoup plus complexe.

Les radiations adaptatives, qui présentent une vaste diversité phénotypique en l'absence de différences moléculaires prononcées, pourraient être considérées comme un laboratoire de « mutants naturels » qui peuvent aider à identifier des variantes fonctionnelles de gènes, un peu comme les criblages de mutagenèse dans les organismes modèles 6 , 7 . Le criblage de variantes aux effets potentiellement importants a révélé des codons stop prématurés dans mitfa et kita , deux gènes essentiels à la survie des mélanophores qui pourraient contribuer aux phénotypes xanthiques (par exemple, Ctenochromis horei ). Les codons stop prématurés étaient également répandus chez Bathybatini pour dlc et hag , où certaines espèces naturelles ont perturbé les motifs barrés ressemblant à des mutants knockout du poisson zèbre de ces gènes 63 .

Six des sept gènes d'opsine ont montré des taux plus rapides de sélection positive dans le troupeau d'espèces du lac Tanganyika (Fig. 4c et Tableau supplémentaire 10 ), ce qui suggère que ce rayonnement adaptatif a coïncidé avec la diversification du système visuel 64 . Pour le septième gène lws , un modèle montrant une décélération de la sélection positive dans le troupeau du lac Tanganyika suivie d'une accélération dans Haplochromini correspondait le mieux aux données. Selon l'AIC, CmC prenant en compte les taux divergents associés aux traits écologiques expliquait mieux la variation de séquence que les modèles neutres dans cinq des sept opsines (Fig. 4c et Tableau supplémentaire 11 ). Dans quatre de ces cinq gènes, le régime alimentaire avait le pouvoir explicatif le plus élevé parmi tous les facteurs écologiques et du cycle biologique testés (Fig. 4c ). Par exemple, les cichlidés planctonophages affichent des taux d'évolution plus rapides pour l'opsine sws1 sensible aux UV , ce qui concorde avec l'expression plus élevée observée de ce gène par rapport aux autres cichlidés 65 . Français Cette découverte concorde avec le fait qu'une sensibilité accrue aux UV conférerait une plus grande efficacité dans la recherche de nourriture sur le plancton, qui est translucide sauf sous la lumière UV. En revanche, les cichlidés broutant des Aufwuchs (algues adhérant aux surfaces ouvertes et autres petits organismes et matières organiques qui y sont attachés) présentent les taux les plus rapides dans l'opsine rh2a-α sensible au vert . La CmC permettant des taux différents chez les cichlidés vivant en eau peu profonde et ceux vivant en eau profonde s'adapte mieux aux données pour lws (absorption λ max ~565 nm) et en deuxième position pour sws1 (absorption λ max ~375 nm), dans les deux cas les cichlidés vivant en eau peu profonde ayant des taux de sélection positive plus rapides. En revanche, les cichlidés vivant en eau profonde avaient des taux plus élevés pour sws2b (absorption λ max ~425 nm). Cela est logique étant donné que les UV et la lumière rouge sont diminués du spectre lumineux en eau profonde 66 . Ces données corroborent la pseudogénisation de sws1 chez la tribu des Bathybatini vivant en eaux profondes (tous les individus présentaient des codons stop prématurés). Malgré des différences notables dans l'AIC avec d'autres modèles, la répartition de CmC en fonction de la profondeur n'était pas significative pour lws après correction de Benjamini-Hochberg. Ces résultats, combinés à des études antérieures ayant révélé une évolution divergente de l'opsine rh1 de faible luminosité entre les cichlidés du Tanganyika d'eaux profondes et peu profondes 67, soutiennent la profondeur comme un moteur important dans l'évolution des opsines sensibles à la couleur. Les modèles CmC tenant compte des différences entre les espèces avec et sans dimorphisme de couleur lié au sexe et entre les cichlidés se reproduisant sur substrat et les cichlidés se reproduisant dans la bouche s'ajustent aux données significativement mieux que le modèle nul (évolution neutre) uniquement pour les gènes d'opsines sensibles aux courtes longueurs d'onde (absorption λ max  < 470 nm). Dans tous les cas, les espèces sexuellement monomorphes et se reproduisant sur substrat avaient des taux plus rapides que les cichlidés sexuellement dimorphes ou se reproduisant dans la bouche (tableau supplémentaire 11 ). Les analyses évolutives moléculaires des 29 loci associés à l'innovation sélectionnés ont révélé des schémas intéressants liés aux radiations adaptatives, à l'écologie et au cycle biologique des cichlidés, mais la généralité de ces résultats devra être confirmée, réfutée ou ajustée en utilisant des approches génomiques plus larges telles que le reséquençage du génome.

Les données phylogénomiques ont été générées au Center for Anchored Phylogenetics ( www.anchoredphylogeny.com ) en utilisant la méthodologie d'enrichissement hybride ancré 68 . Brièvement, l'ADN a été extrait des clips de nageoires à l'aide du ZR-96 Genomic DNA Tissue MiniPrep (Zymo, CA, États-Unis) et les extraits d'ADN ont été cisaillés à 150-300 pb à l'aide d'un ultrasonateur focalisé Covaris E220. Les bibliothèques indexées ont été préparées sur un robot de manipulation de liquides Beckman-Coulter Biomek FXp selon Meyer et al. 69 avec une étape supplémentaire de sélection de taille après la réparation des extrémités franches à l'aide de billes SPRIselect (Beckman-Coulter ; rapport billes:volume d'échantillon de 0,93). Les échantillons indexés ont été regroupés en quantités égales (12-16 échantillons par pool) et des enrichissements ont été effectués sur chaque pool multi-échantillons à l'aide d'un kit Agilent Custom SureSelect (Agilent Technologies, Californie, États-Unis). Après enrichissement, les pools ont été regroupés en quantités égales pour le séquençage en quatre pistes Illumina HiSeq2000 de 150 pb appariées. Le séquençage a été réalisé au Translational Science Laboratory de la faculté de médecine de l'université d'État de Floride. Les lectures appariées se chevauchant provenant de fragments < 280 pb ont été fusionnées, les erreurs de séquençage corrigées et les séquences adaptatrices supprimées. Les lectures ont été assemblées à l'aide d'une approche quasi-de novo dans un pipeline interne 70 . Des ensembles orthologues ont été identifiés à partir des séquences consensus assemblées en utilisant la similarité des séquences et le clustering dans un processus de type neighbor-joining 70 .

Les loci ciblés correspondent aux loci ancrés pour les téléostéens 71 , conçus à partir d'exons individuels de 260 familles de gènes sélectionnées pour leur bonne performance phylogénétique et leur faible nombre de copies. De plus, nous avons complété l'ensemble d'appâts avec 29 gènes (176 exons) avec des fonctions liées à la vision des couleurs, à la coloration et à la formation des os et des dents (Tableau supplémentaire 5 ). Des sondes pour les 29 gènes candidats ont été conçues à partir d'alignements d'exons de trois cichlidés africains ( Oreochromis niloticus , Metriaclima zebra et Pundamilia nyererei ) en utilisant les annotations du génome d'O. niloticus (Orenil1.0).

En plus des espèces échantillonnées, des séquences homologues de neuf génomes de cichlidés disponibles ont été ajoutées aux alignements de loci ancrés : O. niloticus 72 , Astotilapia burtoni 72 , M. zebra 72 , Neolamprologus brichardi 72 , P. nyererei 72 , Amphilophus citrinellus (A. Meyer, Université de Constance), Andinoacara coeruleopunctatus (M. Malinsky, Wellcome Trust Sanger Institute), Petrochromis trewavasae et Tropheus moorii (C. Sturmbauer, Université de Graz). Les orthologues ont été identifiés par des recherches BLAST réciproques et les coordonnées des correspondances ont été étendues de 500 pb en amont et en aval pour capturer les régions moins conservées flanquant les exons. Les loci individuels ont été alignés avec MAFFT v.7245 73 et les positions avec >80% d'écarts ont été supprimées. Huit des 541 loci initialement assemblés ont été exclus en raison d'une paralogie suspectée : un locus (KCNJ13) a produit des correspondances BLAST dans deux régions du génome d'O. niloticus et a été identifié comme dupliqué 72 ; les sept loci restants présentaient une proportion élevée (> 3 %) d'appels de bases ambigus, suggérant que des séquences consensus pourraient avoir été assemblées à partir de lectures provenant de plusieurs paralogues. Des distances génétiques par paires et une visualisation manuelle des alignements ont été utilisées pour garantir une orthologie correcte et supprimer toute séquence non homologue dans les génomes ajoutés.

La datation moléculaire a été réalisée avec RelTime 77 tel qu'implémenté dans MEGA-CC v.7.0.20 78 . Nous avons utilisé le GTR + Γ avec cinq catégories gamma (le modèle prédominant pour les loci uniques identifiés avec jModeltest 79 ), supposé le modèle « horloges locales », réglé le filtre d'échange de branches sur « Aucun » et fixé la topologie à celle de l'arbre de vraisemblance maximale (Fig. 1 supplémentaire ). Pour obtenir des temps de divergence robustes et comprendre l'effet de différents étalonnages fossiles, nous avons effectué des analyses indépendantes en utilisant dix schémas d'étalonnage : Le premier schéma (C01) supposait des divisions vicariantes associées à la fragmentation gondwanienne. Les schémas C02-C03 utilisent respectivement cinq et quatre étalonnages fossiles et sont donc indépendants des hypothèses de vicariance. Les schémas C04-C05 étendent respectivement C02-C03 en appliquant des contraintes maximales pour les nœuds affectés par la vicariance dans C01. Les schémas C06–C10 correspondent exactement aux schémas C01–C05, à la différence qu'ils incluent tous † Tugenchromis pickfordi 37 (voir le tableau supplémentaire 2 pour plus de détails sur les schémas d'étalonnage). RelTime utilise uniquement les bornes d'étalonnage minimales et maximales sans supposer de distribution de probabilité spécifique. Le logiciel BEAST, couramment utilisé, s'est avéré peu performant sur ce vaste ensemble de données, qui n'a pas pu converger malgré de longs temps d'exécution sur de puissants serveurs multi-CPU et multi-GPU.

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